Analisi del DNA sempre più affidabili
Cy0: il nuovo metodo consegnato ai RIS velocizzerà le indagini scientifiche

30 marzo 2011  |  di  |  Pubblicato in In evidenza (B), Slider

Il Dipartimento di Scienze Biomolecolari dell’Università degli Studi di Urbino Carlo Bo, e più precisamente i suoi ricercatori Michele Guescini, Davide Sisti, Laura Stocchi e i prof. Marco Rocchi e Vilberto Stocchi, responsabile della ricerca nonché Prorettore allo Sviluppo e Preside della Facoltà di Scienze Motorie, utilizzando un test particolarmente sensibile per amplificare il materiale genetico, la reazione a catena della polimerasi (PCR), sono riusciti a sviluppare un nuovo metodo denominato Cy0 che consente una procedura sicura e più affidabile di quella standard per la quantificazione degli acidi nucleici presenti nei diversi campioni biologici.

Per merito dei ricercatori, da oggi le analisi sul DNA saranno più precise e affidabili tanto da ridurre drasticamente le possibilità di errore anche quando si avranno a disposizione pochi picogrammi di materiale genetico.

I risultati della ricerca consentiranno di analizzare i geni in modo più approfondito così da offrire la possibilità a scienziati di tutto il mondo di avere una mole di dati enorme a disposizione, contribuendo ad apportare sviluppi straordinari e altrettanti benefici in molti settori.

La scoperta è rivoluzionaria considerando i casi di cronaca nera ancora irrisolti a causa di quantità insufficiente per l’individuazione di profili genetici utilizzabili ai fini dell’indagine.

La tecnica del Dipartimento di Urbino permette, invece, da poche cellule, ovvero da pochissimo DNA, di ottenere tantissime copie proprio di quei tratti del DNA che sono diversi da individuo a individuo. Infatti, il metodo sviluppato (metodo Cy0) permette una quantificazione affidabile anche quando le condizioni di amplificazione non sono ottimali.

Prof. Stocchi come ci siete riusciti?

Il responsabile della ricerca Prof. Vilberto Stocchi, Prorettore allo Sviluppo e Preside della Facoltà di Scienze Motorie

Il responsabile della ricerca Prof. Vilberto Stocchi, Prorettore allo Sviluppo e Preside della Facoltà di Scienze Motorie

Qualche anno fa ci siamo posti il problema di come documentare, in modo rigoroso, scientifico, i benefici indotti dall’esercizio fisico nella prevenzione delle malattie croniche moderne come l’obesità, la sindrome metabolica, il diabete di tipo 2, l’ipertensione, ecc. La valutazione dei benefici indotti dall’esercizio fisico può essere fatta valutando diversi parametri. Per quanto riguarda i campioni biologici che possono essere utilizzati è possibile prelevare campioni di sangue, utilizzare le urine e la saliva ed eseguire biopsie muscolari. Il prelievo di sangue, l’utilizzo delle urine e della saliva, in sostanza, non sono invasivi. Diverso è per la biopsia muscolare che richiede il ricorso all’anestesia – inoltre, secondo le indicazioni dei Comitati Etici delle Facoltà di Medicina o delle diverse Strutture Ospedaliere – si può ricorrere all’uso della biopsia muscolare per giustificati motivi diagnostici. Il muscolo scheletrico è il tessuto, direttamente coinvolto nel processo di conversione dell’energia chimica in energia meccanica – realizzando di fatto il movimento – quindi, la cellula del muscolo scheletrico è direttamente coinvolta nelle modificazioni metaboliche e funzionali e rappresenta quindi un campione biologico importante.

Nel 2007 è stato possibile pubblicare un nostro lavoro – in cui abbiamo dimostrato che utilizzando la metodologia dell’ago aspirato, già utilizzata da diversi anni in ambito clinico-diagnostico, è possibile prelevare – in modo sostanzialmente, non invasivo, e senza la necessità di ricorrere all’anestesia – una quantità davvero minima di tessuto muscolare. Quantità minima, ma sufficiente, per ottenere un numero davvero significativo di informazioni a livello molecolare riguardanti la struttura e la funzione della cellula del muscolo scheletrico. In particolare, come biochimici abbiamo rivolto il nostro interesse ad una settantina di geni chiave, coinvolti nella biogenesi mitocondriale, in diverse vie metaboliche oltre alla possibilità determinare la quantità di DNA mitocondriale – la cui integrità – correla con lo stato di salute della persona. Per ottenere, queste informazioni, è stato necessario utilizzare metodi per l’analisi del DNA che permettessero di farlo nel modo più accurato a partire da quantità minime di materiale biologico. I risultati di questo lavoro sono stati pubblicati nel 2007 dimostrando che l’utilizzo della metodologia dell’ago aspirato – unita a metodi sensibili ed accurati per l’analisi del DNA – permetteva di evitare la tradizionale biopsia muscolare ed ottenere dalla minima quantità di tessuto prelevato un numero davvero significativo di informazioni riguardanti la condizione metabolica della cellula del muscolo scheletrico. Questo è stato possibile grazie ad una particolare attenzione rivolta ai metodi utilizzati nel quantificare gli acidi nucleici. Nel 2008 è stato possibile pubblicare su BMC bioinformatics un nostro lavoro – che ha trovato un significativo riscontro nella comunità scientifica internazionale.

Infatti, in pochi giorni ha guadagnato l’indicazione “highly accessed” e a tutt’oggi il pdf è stato scaricato da oltre 6250 colleghi. Questo ci ha spinto a fare qualche altro passo in avanti con la pubblicazione di un secondo lavoro nel 2010 che ha ricevuto l’interesse suscitato dal primo.

Tuttavia, i risultati da noi ottenuti non sarebbero stati così facilmente fruibili dagli altri colleghi – se non da parte di alcuni specialisti. E’ stato questo il motivo che ci ha portato a sviluppare un software applicativo. Il lavoro da noi svolto trova applicazione nei diversi ambiti della ricerca medico-biologica, ogni qualvolta che si rende necessario amplificare minime quantità di DNA per ulteriori studi.

Il software è stato consegnato ai fini delle investigazioni scientifiche al Direttore del Servizio di Polizia Scientifica della Direzione Centrale Anticrimine del Ministero dell’Interno, Dr. Piero Angeloni, che durante la presentazione della ricerca avvenuta lo scorso 23 marzo, ha dichiarato: questo metodo è importantissimo per le nostre indagini e potremo renderle più veloci, anche per il caso di Yara Gambirasio. La collaborazione tra polizia scientifica e ricerca è fondamentale per migliorare i risultati del nostro lavoro. Il software sarà reso disponibile anche ai RIS, il Reparto di Investigazioni Scientifiche dell’Arma dei Carabinieri.

I risultati ottenuti  sono visibili sul sito web http://www.cy0team.uniurb.it in cui è possibile effettuare l’upload di file risultati da analisi real-time PCR.

Nell’arco di un paio di mesiconclude il prof. Stocchioltre 4.300 colleghi hanno visitato il sito e inviato i propri dati per l’analisi del DNA. Un esempio, tra tanti, riguarda un ricercatore del National Institute of Health di Washington che, dopo averci inviato i file dati di 1600 campioni, ha deciso di adottare la metodologia messa a punto dal Dipartimento di Scienze Biomolecolari dell’Università di Urbino.

LE DIFFERENZE DI METODI

I dati disponibili in letteratura riportano che una piccola differenza di efficienza di amplificazione tra i campioni da analizzare può condurre a significativi errori di quantificazione. Per esempio, utilizzando i metodi standard (Ct), una diminuzione del 4% dell’efficienza di reazione può portare ad un errore del 400% nella stima della quantità di DNA presente nel campione biologico.

LO STUDIO

L’obiettivo di questo lavoro è stato quello di sviluppare una nuova procedura  per la quantificazione degli acidi nucleici mediante la tecnica real-time PCR. Le strategia proposta permette di superare le limitazioni dei metodi standard che richiedono uguale efficienza di amplificazione tra il campione sconosciuto e i campioni noti utilizzati per costruire la curva standard.

Questo assunto è un aspetto fondamentale nella quantificazione in real-time PCR. Nella strategia che proponiamo in questo studio (metodo Cy0), per la prima volta vengono combinate la stabilità e l’affidabilità della curva standard con la possibilità di tener conto delle variazioni delle singole efficienze di reazione.

Lavori precedenti hanno riportato che il metodo SCF è in grado di quantificare correttamente un campione di DNA senza il bisogno di conoscere “a priori” l’efficienza della reazione di amplificazione. L’efficacia del metodo SCF si basa sul fitting delle fluorescenze grezze in modo che le variazioni dei singoli campioni siano considerate durante l’analisi. Sorprendentemente, i risultati riportati nel nostro studio dimostrano che l’accuratezza e la precisione del metodo SCF era significativamente compromessa in presenza di una  diminuzione dell’efficienza di reazione.

NUOVE INDICAZIONI PER L’ANALISI DEL DNA

Confrontando il metodo proposto (Cy0) con il metodo “gold standard” Ct e con il metodo Cp, spesso usato in diagnostica molecolare, i risultati ottenuti dimostrano che in condizioni di quantificazione ottimali questi tre metodi sono precisi e accurati in maniera comparabile.

Tuttavia, in presenza di fattori che possono inibire il processo di amplificazione, come per esempio la presenza di IgG, flavonoidi, tannini, ecc.,  i metodi Ct e Cp non risultano sufficientemente accurati mentre il metodo Cy0 fornisce risultati significativamente più precisi.

In conclusione, il metodo Cy0 combina le metodologie della curva standard con una procedura di fitting che permette di superare il problema della determinazione dell’efficienza della PCR nella quantificazione degli acidi nucleici mediante real-time PCR. I risultati  ottenuti dimostrano in modo chiaro che il metodo Cy0 rappresenta un metodo più affidabile rispetto ai metodi attualmente in uso con la possibilità di ottenere una quantificazione precisa ed accurata anche in presenza di condizioni di amplificazione non ottimali.

SLIDES DEGLI INTERVENTI

  • Relazione prof. Vilberto Stocchi – Responsabile della Ricerca | PDF
  • Relazione dott. Michele Guescini | PDF
  • Relazione dott. Davide Sisti | PDF
  • Relazione dott. Renato Panebianco | PDF

RASSEGNA STAMPA SCIENTIFICA

  • A new real-time PCR method to overcome significant quantitative inaccuracy due to slight amplification inhibition | PDF
  • Fine needle aspiration coupled with real-time PCR | PDF
  • Shape based kinetic outlier detection in real-time PCR | PDF

PHOTOGALLERY DELL’EVENTO

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